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蛋白羟基化修饰组位点鉴定

大多数动物在氧化磷酸化过程中利用O2作为主要代谢底物。由于绝对依赖O2的持续供应，动物已经进化出一种在细胞水平上适应缺氧的机制。这是由缺氧诱导因子 (HIF) 的激活介导的。在缺氧条件下，细胞氧需求超过供应，HIF 会保持稳定并诱导 HIF 靶基因的转录，从而促进一系列适应机制，包括通过糖酵解增强无氧 ATP 生成、通过血管生成增加氧供应以及通过红细胞生成增加血液氧合。

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HIF-α 以较高的基础速率合成；然而，一旦合成，只要有足够的非线粒体氧气，它就会迅速降解。HIF 脯氨酰 4-羟化酶 PHD1、PHD2 和 PHD3（也分别称为 EGLN2、EGLN1 和 EGLN3）赋予 HIF-α 亚基以氧气依赖性靶向蛋白酶体降解。在人类中，PHD 可羟基化 HIF-α 亚基上的两个脯氨酸残基 (HIF-1α: Pro402 和 564; HIF-2α: Pro405 和 Pro531)，从而触发由 von Hippel-Lindau 肿瘤抑制蛋白 (pVHL)、延长蛋白 B 和 C、Cullin 2 和 RING-box 1 蛋白形成的多聚体 E3 泛素连接酶复合物识别它们。

PHD 需要依靠氧气 (O 2 )、铁 (Fe2+ )、α-酮戊二酸 (也称为 2-草酰戊二酸；2-OG) 和抗坏血酸 (维生素 C) 才能发生羟基化。 PHD在 2-OG 的氧化脱羧过程中利用 O2中的一个氧原子生成琥珀酸和 CO 2，另一个氧原子直接结合到 HIF-α 的氧化氨基酸残基中。PHD 是一种双加氧酶，因为它们将两个分子氧原子都结合到其靶标中。如果细胞内没有足够的 O 2、2-OG 或 Fe2+，PHD 就无法羟基化 HIF-α 亚基以标记它们进行降解。因此，在缺氧条件下，HIF-α 亚基是稳定的，并且可以与 HIF-1β 结合形成具有转录活性的二聚体，从而诱导 HIF 靶基因的转录

因子抑制 HIF (FIH) 是另一种酶，它通过羟基化 HIF-1α 和 2α 的 C 末端转录激活域 (CTAD) 内的天冬酰胺残基 (人类 HIF-1α 中的 Asn803；人类 HIF-2α 中的 Asn851)来抑制常氧条件下的 HIF-α 信号传导。这种羟基化可防止转录辅激活剂组蛋白乙酰转移酶 p300/CREB 结合蛋白 (p300/CBP) 的结合，从而降低 HIF 的羧基末端转录激活域活性。与脯氨酰羟基化一样，FIH 的天冬酰胺酰羟基化在缺氧条件下会减少，从而解除对 HIF 转录激活的抑制。

PHD 酶表现出独特的组织特异性表达模式。在细胞水平上，PHD1 主要在细胞核内表达，而 PHD2 可在细胞质中发现，PHD3 在细胞核和细胞质中均有表达。尽管所有PHD 都普遍表达，但它们的表达水平表现出组织特异性差异。PHD2是表达最丰富的 PHD 酶，几乎存在于所有组织中，而在睾丸和心脏中，PHD1 和 PHD3 分别是表达最高的酶 [ 17 ]。在 HIF 信号转导中，PHD2 是主要的氧传感器。PHD2 基因的纯合缺失与生命不相容，PHD2 的部分缺失 (PHD2 +/− ) 或细胞类型特异性 PHD2 缺失会强烈增加 HIF 表达。相反，临床前研究表明，PHD1 或 3 纯合缺失的动物是可以存活的。对转基因动物的进一步研究为了解单个 PHD 酶在慢性疾病发展过程中的作用提供了有趣的见解。例如，PHD1 缺陷小鼠可免受结肠炎或肝脏病变（如胆道纤维化或缺血/再灌注损伤）的影响。

通过脯氨酰羟基化进行翻译后修饰是一种众所周知的现象。在细胞外胶原蛋白中，超过 30% 的脯氨酸可被羟基化，这是由位于内质网内的胶原脯氨酰羟化酶 (CPH) 家族所致。CPH 由两个不同的酶家族组成，即胶原脯氨酰 4-羟化酶和胶原脯氨酰 3-羟化酶，它们具有不同的功能。然而，由于脯氨酰 4-羟基化是人类中最常见的翻译后修饰，因此在本综述中我们将重点关注脯氨酰 4-羟化酶。

检测蛋白质羟基化的方法

筛选、检测和验证 PHD 或 FIH 介导的翻译后修饰的替代功能靶点在技术上具有挑战性。粗略回顾文献可发现，用于检测和确认 PHD 或 FIH 介导的翻译后修饰的替代靶点的方法和技术存在很大差异。

• • 细胞培养特异性探针标记(Specific Probe labeling cells)
• • 鉴定 PHD 所致脯氨酰羟基化的一种方法是通过测量由 [14C]-羧基标记底物（如放射性标记的 2-OG）形成的14CO 2来监测其活性。
• • 通过对 HIF-α 亚基的氧依赖性降解结构域 (ODD) 中存在的 HIF-α“共识序列”LXXLAP（X 代表任意氨基酸）的假定羟基化靶标进行计算机筛选，可以根据与已知靶标的序列相似性识别 PHD 介导羟基化的其他假定底物。
• • 质谱法 (MS) 是检测细胞提取物中蛋白质羟基化的最常用方法之一。脯氨酸、赖氨酸或天冬酰胺的羟基化涉及用羟基取代氢原子，使总质量增加 16 Da。然而，MS 检测到的羟脯氨酸的总质量（113Da）与其他未修饰氨基酸（如亮氨酸和异亮氨酸）的总质量相同。因此，将氨基酸序列从脯氨酸变为亮氨酸的突变可能会被误认为是脯氨酸残基的羟基化。
• • 检测假定的脯氨酰羟基化靶标的另一种方法是基于 von Hippel-Lindau 蛋白 (pVHL) 捕获的方法。VHL 通常检测脯氨酰羟基化 HIF-α，可以通过不同的点突变进行基因改造，从而使 VHL 能够识别更广泛的羟脯氨酸残基。
• • 羟基化肽的验证可以通过一系列不同的体外和体内免疫检测方法来确定，包括先进的克隆技术、免疫沉淀、蛋白质印迹，例如使用特定的抗羟脯氨酸 (Pro402 和 Pro564) 和抗羟基天冬酰胺 (Asn803) 抗体。

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