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KD 稳定细胞系构建

大多数细胞生物学实验使用短暂转染方案,在转染后的24-96小时内达到基因表达的峰值。然而,如果需要长时间持续的基因表达,构建稳定的细胞系是一个可行的选择。此外,通过限制稀释选择的稳定细胞系提供了遗传同质和克隆的细胞群体。

稳定细胞系的构建可以通过使用阳性选择标记物(如 hygromycin、G418/Geneticin、zeocin 和 blasticidin 抗生素耐药性)来实现。选择标记物可以通过与目标基因在同一质粒上(cis 方式)或与含有目标基因的质粒共转染(trans 方式)来传递。cis 方法通常较为简单,并且更有可能产生抗药性稳定转染体,表达目标基因。当目标构建在质粒骨架中不含抗生素耐药基因时,trans 共转染方法是一个很好的选择。在这种情况下,可以将含有5至10份基因表达质粒和1份抗生素选择标记质粒的质粒混合物引入细胞中。这种质粒比例有助于确保所选细胞同时表达目标基因和选择标记物。

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利用 CRISPR/Cas9 构建稳定敲除细胞系的步骤如下:

1. sgRNA 验证:在实验开始前,可以通过 sgRNA 在线验证,筛选高效率的 sgRNA 用于敲除细胞系的构建。

2. 基因拷贝数:建议在开始实验之前确定目标基因的拷贝数。

3. 质粒质量:使用高质量无内毒素的质粒 DNA。

4. 细胞条件:使用维护良好并经过常规认证的高质量细胞,包括检测细菌,真菌或支原体污染。如果细胞来自新复苏的细胞,则在使用前至少完成2次传代。

5. 设计和合成 sgRNA 和基因型引物。

6. 用 Cas9 和 sgRNA 转染细胞。

7. 使用适当的选择标记筛选敲除细胞。

8. 单细胞克隆分离。

9. 使用 PCR 和测序筛选克隆以确认敲除。

10. 扩增阳性克隆。

11. 通过 Western 印迹或其他方法验证敲除。

12. 检测支原体污染并冻存稳定敲除细胞。

构建KD稳定细胞系的优势:

  • 持续的基因沉默:稳定的敲低细胞系提供了长期和稳定的基因沉默,与瞬时敲低方法相比,可以持续较长时间的基因沉默[1]。这使得可以研究基因功能和通路信号在长时间内的作用。
  • 同质性和克隆性:通过有限稀释法产生稳定的敲低细胞系,提供了基因同质和克隆的细胞群体。这确保了实验结果的一致性和可重复性。
  • 减少变异:稳定的敲低细胞系克服了与瞬时转染方法相关的变异问题;它们可以在较长的时间内保持靶基因的表达水平稳定,而不会有明显的变化。
  • 实验设计的灵活性:稳定的敲低细胞系可以被设计成加入额外的基因调控生物学机制,例如诱导化学或环境事件导致基因沉默。这使得能够更精确地控制基因表达。
  • 多功能性:稳定的敲低细胞系可用于各种应用,包括基因功能研究、途径分析、药物筛选和重组蛋白质生产。它们为了解基因功能和研究基因沉默的影响提供了有价值的工具。

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