本试剂盒基于点击化学（Click Chemistry）原理开发，专门用于对活细胞中目标蛋白的豆蔻酰化修饰进行特异性标记与检测，并通过免疫印迹法（Western Blot）进行结果读取。豆蔻酰化是一种将14-碳饱和脂肪酸（肉豆蔻酸）共翻译或翻译后连接到蛋白质N端甘氨酸的脂质修饰，由N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）催化。本试剂盒通过代谢标记和铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC），实现对目标蛋白豆蔻酰化修饰的高灵敏度、特异性检测。
| 参数 | 规格 |
|---|---|
| 检测原理 | 点击化学（Click Chemistry， CuAAC） |
| 主要应用 | 活细胞中特定蛋白的N-端豆蔻酰化修饰检测 |
| 检测方法 | 免疫印迹法（Western Blot） |
| 结果读取 | 链霉亲和素-HRP（Streptavidin-HRP）化学发光检测 |
| 关键酶 | N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）依赖性 |
| 保存条件 | 所有组分4°C保存（具体参见组分表） |
| 用户自备 | 炔基标记的肉豆蔻酸探针（如Alk-Myr）、铜催化剂、Western Blot相关试剂 |
| 试剂名称 | 组分编号 | 体积 | 储存条件 |
|---|---|---|---|
| Probe Reaction Buffer | Solution I | 260 μL | 4℃ |
| Lysis Buffer | Solution II | 10 mL | 4℃ |
| CUAAC Click Labeling Buffer | Solution III | 450 μL | 4℃ (避光) |
| Blocking Reagent | Solution IV | 340 μL | 4℃ |
| Streptavidin-Beads | Solution V | 1300 μL | 4℃ |
| 说明书 | 1份 |
| 试剂名称 | 组分编号 | 体积 | 储存条件 |
|---|---|---|---|
| Probe Reaction Buffer | Solution I | 60 μL | 4℃ |
| Lysis Buffer | Solution II | 2400 μL | 4℃ |
| CUAAC Click Labeling Buffer | Solution III | 80 μL | 4℃ (避光) |
| Blocking Reagent | Solution IV | 80 μL | 4℃ |
| Streptavidin-Beads | Solution V | 260 μL | 4℃ |
本试剂盒基于点击化学原理。首先，在活细胞中，带有炔基标记的肉豆蔻酸类似物（探针）通过N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）的催化作用，共翻译或翻译后修饰到目标蛋白的N端甘氨酸上。裂解细胞后，利用含有叠氮基团的生物素（Azide-Biotin）通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）特异性标记已修饰的蛋白。最后通过链霉亲和素-HRP（Streptavidin-HRP）进行Western Blot检测，实现目标蛋白豆蔻酰化修饰的特异性、高灵敏度分析。
本试剂盒包含Click Chemistry标记和Pull-down所需的主要缓冲液和链霉亲和素磁珠。实验前用户需自备：1）带有炔基标记的肉豆蔻酸探针（如Alk-Myr，通常为商品化试剂或可向Aimsmass单独订购）；2）用于标记反应的铜催化剂（通常为CuSO4和还原剂THPTA或BTTAA等，部分Click反应缓冲液已包含，请参照说明书）；3）细胞培养和裂解常规试剂（如PBS、细胞刮等）；4）Western Blot全套试剂（如SDS-PAGE凝胶、转膜系统、HRP底物等）。
信号缺失可能原因：1）目标蛋白在该实验条件下不发生豆蔻酰化修饰；2）探针标记效率低（探针浓度、孵育时间或NMT活性不足）；3）细胞裂解不充分或蛋白降解；4）点击化学（CuAAC）反应条件未优化（如催化剂浓度、反应时间）；5）Western Blot检测系统灵敏度不足。建议：设置阳性对照（已知豆蔻酰化蛋白），优化探针标记和Click反应条件，并确保免疫印迹各步骤高效进行。
本试剂盒所有组分（Solution I-V）均建议在4°C保存，保持稳定。收到产品后请按说明书要求存放。其中Click反应相关的溶液（如Solution III）对光敏感，建议避光保存。请勿反复冻融。自备的探针和催化剂请按其产品说明书要求保存（通常-20°C或-80°C）。
